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实验的每一小步，都是决定结果的一大步。本期将为大家讲解IHC/ICC实验中检测和显像的方法，喜欢的话就继续往下看吧！

与一抗孵育之后，可利用适当的检测系统来观察抗体结合。检测方法可以是直接的，也可以是间接的，产生荧光或显色信号。直接检测涉及到与标记直接结合的一抗的使用。间接检测方法则利用标记由一抗的宿主物种中产生的二抗。间接方法还包括放大步骤，以增强信号强度。观察表位-抗体相互作用的常用标记包括一些荧光基团和酶，这些酶将可溶的底物转化成不可溶、显色的终产物。标记的选择受到检测方法、个人偏好以及可用的显微镜设备的影响。

直接或间接检测，信号放大

选择直接检测还是间接检测，这常常取决于抗原的表达水平。例如，高表达表位的检测可通过与标记直接结合的一抗来实现。直接检测的优点包括多色染色更为简单，且没有二抗非特异结合的顾虑。主要缺点在于直接检测达不到观察较低表达水平的灵敏度。在极少数情况下标记过程可能会对一抗的亲和力产生不良影响。

相比之下，间接检测方法通常有着更高水平的灵敏度，并产生更强烈的信号。信号经过间接方法放大，因为至少有两个标记的二抗与每个一抗结合。不过，二抗的使用需要额外的封闭步骤和对照。

利用亲和素和链霉亲和素与生物素的强亲和力，可实现信号的进一步放大。亲和素是一种存在于蛋清中的糖蛋白，按化学计量与生物素结合。链霉亲和素纯化自链霉菌 Streptomyces avidinii ，未糖基化，表现出比亲和素更低的非特异结合。两种蛋白的每个分子都结合四个生物素。如果采用生物素化的二抗，那么通过与亲和素-生物素（ABC方法）或标记的链霉亲和素-生物素（LSAB 方法）的孵育可明显放大信号。链霉亲和素可与检测酶（辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或荧光染料结合。使用这些放大方法需要额外的步骤来防止非特异结合。

检测方法与信号强度

荧光检测

荧光检测是基于荧光色素的使用，它们在受到较短波长的光激发时发光。荧光色素可直接与一抗或二抗结合，或与链霉亲和素结合。免疫荧光常用于多个细胞目标的同时观察。例如，组织可与不同的一抗混合物孵育，再与结合有荧光色素的二抗孵育，这些荧光染料在不同波长下发光。

多色实验必须经过设计，以限制检测试剂之间的交叉反应性，以及所使用的荧光染料在光谱性质上的交叉。为了限制二抗之间的交叉反应性，一抗应来自不同的物种。这样就能使用物种特异的二抗，分别只识别一个一抗。不过，也有一些情况，需要同时使用同一个物种的抗体。这可通过使用一个生物素化的一抗来实现。在使用这种技术时组织必须先与非生物素化的抗体孵育，再与荧光基团结合的二抗孵育。之后将组织与生物素化的一抗孵育，再与链霉亲和素结合的荧光色素孵育。这种方法确保链霉亲和素结合物只与生物素化的抗体结合，限制了交叉反应性。

多色荧光显微镜。典型的免疫荧光设置包括光源、适合目的荧光染料的滤光片组合，以及检测机制。

R&D Systems的 NorthernLights 荧光色素有着不重叠的光谱性质，非常适合多色IHC和ICC。A. NorthernLights-493 anti-goat igG（货号 NL003：绿色）和 NorthernLights-557 anti-mouse IgG（货号 NL007：红色）的发射曲线。B. 利用 anti-rat Nestin 亲和纯化的多克隆抗体（货号 AF2736：绿色）和 anti-neuron specific beta-III Tubulin 单克隆抗体（克隆号 TUJ-1）（货号 MAB1195：红色）多色检测大鼠皮层干细胞中的 Nestin和 beta-III Tubulin。细胞经过NorthernLights-493（货号 NL003：绿色）和 NorthernLights-557（货号 NL007：红色）二抗染色，并经 DAPI（蓝色）复染。

显色检测

为了方便显色检测，一抗、二抗或链霉亲和素可与酶结合。在加入可溶的有机底物时，酶与底物反应，产生不溶的有色产物，沉积在抗原表达的位置。常用的酶包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶，它们分别将3,3' 二氨基联苯胺（DAB）和 3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）转化成棕色和红色的终产物。DAB比AEC 更常用，因为后者易溶于酒精，且暴露在过度光照下时更容易褪色。在使用 AEC 时必须用水性的复染剂和封片剂。

通常认为显色检测比免疫荧光更为灵敏，但没那么方便，因为孵育和封闭步骤更多。与免疫荧光相似，显色检测也允许多个抗原的观察，但这些抗原只能在细胞和组织的不同位置，因为重叠的颜色可能会使结果难以解释。DAB显色检测的好处在于，HRP和DAB发生反应生成的有色沉淀物对光不敏感，玻片可保存数年。与需要专门光源和滤光片组合的荧光显微镜不同，显色技术只需要一般的光学显微镜。

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